As análises de lipídeos consistem em duas etapas principais: 1) extração de lipídeos e 2) identificação de estruturas para quantificação.
A extração é realizada com o objetivo de separar e concentrar os lipídeos de interesse derivados de uma matriz biológica. O caráter hidrofóbico de grande parte dos lipídeos facilita sua extração que geralmente é executada com uma mistura de solventes orgânicos (como metanol e clorofórmio) e água, também conhecida por extração líquido-líquido.
Biomoléculas mais polares (como proteínas e carboidratos), que podem interferir na qualidade das análises, tendem a ficar na fase aquosa, enquanto a grande maioria dos lipídeos são isolados na fase orgânica. Neste processo são adicionados à matriz biológica um coquetel de padrões internos, com pelo menos um representante por classe lipídica a ser quantificada.
Uma vez extraído da amostra de interesse, os lipídeos são injetados diretamente no cromatógrafo líquido associado ao espectrômetro de massas (LC-MS). A cada grupo de amostras experimentais a ser analisado, injetamos controles de qualidade representados por uma mistura contendo uma alíquota de cada amostra experimental. E, dessa maneira, podemos testar a eficiência de reprodutibilidade do método.
A cromatografia líquida tem como função separar lipídeos de acordo com as suas propriedades físico-químicas e portanto de maneira cadenciada os lipídeos atingem a interface do espectrômetro de massas em tempos de retenção distintos. Nessa interface os lipídeos são ionizados dentro de uma nuvem de spray e adquirem individualmente carga positiva ou negativa possibilitando assim adentrarem o espectrômetro de massas.
Dentro do massas, os lipídeos, agora na forma de íons, são direcionados e organizados até atingirem o analisador de massas (tempo de voo, orbitrap, etc), pelo qual são quantificados através do dado de massa obtido pela molécula intacta ou íons precursores (também chamado MS1). Os espectrômetros de massas de alta resolução são capazes de realizar experimentos fragmentação ou MS/MS, onde os íons precursores mais abundantes em uma amostra são literalmente quebrados em pequenas pedaços. A elucidação de moléculas em MS/MS só é possível graças à fragmentação sistemática dos lipídeos, ou seja, lipídeos da mesma classe produzem fragmentos idênticos, sendo o grande diferencial a composição das cadeias acilas (comumente representadas por ácidos graxos).
Combinando o tempo de retenção do íon precursor, sua massa exata em MS1 e os padrões de fragmentação em MS/MS, podemos obter uma quantificação precisa das moléculas lipídicas. Uma vez identificados e quantificados em MS1, normaliza-se os lipídeos de interesse pelo seus respectivos padrões internos de acordo com suas classes para obter suas concentrações.
Na PinguisLab, os dados são reportado em mol e permitem entre outros a quantificação das cadeias individuais de ácidos graxos em fosfolipídeos.
A PinguisLab tem como foco a excelência na identificação e quantificação precisa de lipídeos, gerando dados ideais para busca por biomarcadores e descoberta de mecanismos moleculares.
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Na PinguisLab, os lipídeos contam a história!
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