Ácidos graxos oxidados, ou oxilipinas, podem ser gerados através de reações de oxido-redução catalisadas por radicais livres ou enzimas como cicloxigenases, lipoxigenases, citocromo P450, dentre outros mecanismos.
Uma vez geradas, as oxilipinas podem desempenhar papéis importantes em sinalização, regulando processos que envolvem desde inflamação até morte celular. Importante ressaltar que as oxilipinas podem apresentar diversos tipos de isomeria, ou seja mesma massa molecular mas diferentes estruturas químicas, além de geralmente estarem presentes em concentrações baixas (nano ou picomolar), o que torna a identificação e quantificação dessas biomoléculas um grande desafio analítico.
A análise de oxilipinas consiste basicamente em duas etapas principais: 1) extração dos analitos e 2) caracterização/quantificação por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS/MS) usando método alvo ou "targeted".
A extração de oxilipinas da amostra de interesse pode ser realizada através da extração em fase sólida (do inglês “solid phase extraction” ou “SPE”), sendo o principal objetivo eliminar interferentes como carboidratos, aminoácidos, proteínas e outros lipídeos. Relativamente polares, quando comparados aos ácidos graxos não oxidados ou outros lipídeos com estruturas mais complexas, as oxilipinas podem ser purificadas por colunas SPE de caráter hidrofóbico do tipo C18 e solventes orgânicos como o metanol. Uma vez extraídas, as oxilipinas são concentradas no menor volume possível, e então analisadas por LC-MS/MS. Importante ressaltar que a extração das oxilipinas é realizada com a adição de padrões internos deuterados, que servem para corrigir perdas durante o processo de extração e diferenças em eficiência de ionização durante análise de espectrometria de massas.
A abordagem analítica utilizada para a análise das oxilipinas pela Oxpin é denominada “Parallel Reaction Monitoring” ou PRM. Utilizando esse tipo de método, as oxilipinas são isoladas e fragmentadas pelo espectrômetro de massas, gerando fragmentos que serão utilizados para elucidar a estrutura química destas biomoléculas. Além disso, curvas de calibrações externas para cada um das oxilipinas monitoradas são construídas, assegurando uma quantificação com alta acurácia e precisão, bem como geração de dados em concentração absoluta. Outra característica da Oxpin é que a análise das oxilipinas é validada com testes de reprodutibilidade intra e inter-dia, precisão, exatidão e recuperação. No total, monitoramos cerca de 60 espécies de oxilipinas, com destaque para prostaglandinas, mono-hidróxidos, di-hidróxidos, epóxidos, resolvinas, leucotrienos, e maresinas.
A PinguisLab tem como foco a excelência na identificação e quantificação precisa de lipídeos, gerando dados ideais para busca por biomarcadores e descoberta de mecanismos moleculares.
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